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中國儀器網 中國儀器網 DNA測序儀

DNA測序儀

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手工測序以及自動測序均屬于DNA序列測定,手工測序可分為maxam-gilbert化學降解法與sanger雙脫氧鏈終止法,事實上,目前dna序列分析的主流是自動測序。373型、377型、310型、3700和3100型等多種型號DNA測序儀均已經被美國pe abi公司生產出來了,在這幾款DNA測序儀中,臨床檢測實驗室使用最多的一種型號要屬310型。

DNA測序儀

DNA測序儀原理

手工測序以及自動測序均屬于DNA序列測定,手工測序可分為maxam-gilbert化學降解法與sanger雙脫氧鏈終止法,事實上,目前dna序列分析的主流是自動測序。373型、377型、310型、3700和3100型等多種型號DNA測序儀均已經被美國pe abi公司生產出來了,在這幾款DNA測序儀中,臨床檢測實驗室使用最多的一種型號要屬310型。


原理

傳統的聚丙烯酰胺平板電泳被淘汰,取而代之的是毛細管電泳,abi prism 310型基因分析儀就是采用毛細管電泳技術,此公司專利的四色熒光染料標記的ddntp得到應用,所以利用單引物pcr測序反應,相差1個堿基的3''''末端為4種不同熒光染料的單鏈dna物混合為生成的pcr產物,使四種熒光染料的測序 pcr產物能夠在一根毛細管內電泳,從而使泳道間遷移率差異的影響得以避免,使測序的精確度得到大大的提高,因為分子大小的差異,在毛細管電泳中有著不一樣的遷移率,當其從毛細管讀數窗口段經過的時候,激光檢測器窗口中的ccd(charge-coupled device)攝影機檢測器能夠逐個檢測熒光分子,利用光柵將激發的熒光分光,來對代表不同堿基信息的不同顏色的熒光加以區分,并且同步成像于ccd攝影機上,不同熒光經過分析軟件能夠被轉變為dna序列,從而使dna測序的目的達到。可以通過熒光吸收峰圖、堿基排列順序或者凝膠電泳圖譜等多種形式將分析結果輸出。


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DNA測序儀是一臺對dna片段的堿基順序或大小進行測定和定量的儀器,其還可以自動數據收集、自動進樣以及自動灌膠。genescan膠(pop 4)和dna測序膠(pop 6)等凝膠高分子聚合物由pe公司提供,這些凝膠顆粒有著均一的孔徑,使配膠條件不相同對測序精度的影響得以避免。電泳附件、電腦、彩色打印機、毛細管電泳裝置等為DNA測序儀的主要構成組件。資料收集,分析和儀

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DNA測序國內發展

手工測序以及自動測序均屬于DNA序列測定,手工測序可分為maxam-gilbert化學降解法與sanger雙脫氧鏈終止法,事實上,目前dna序列分析的主流是自動測序。373型、377型、310型、3700和3100型等多種型號DNA測序儀均已經被美國pe abi公司生產出來了,在這幾款DNA測序儀中,臨床檢測實驗室使用最多的一種型號要屬310型。


國內狀況

當今世界,如果要評說哪個地方會誕生傳奇,那么必定是高科技領域,從前DNA測序還作為一個前沿技術令人高山仰止,如今卻成為一個生命科學常規技術,迅速地得到普及,目前為止,能夠和電腦芯片運算能力增強的速度相媲美的也就只有DNA測序成本下降的速度,DNA測序的發展除了在降低成本方面得到了體現,還在高通量測序大幅度提高了工作效率方面得以表現,其鋪平了DNA測序產業化的道路。


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在DNA測序商業化的浪潮下,完成5個以上有重大經濟價值的基因或蛋白的轉化應用、約500個新的功能基因的發現,10000種微生物、100種動植物基因組測序等目標在我國《生物產業發展“十二五”規劃》中被提出。根據30-50萬元為微生物進行“基因組完成圖”測序的大致費用而言,千億元級別為DNA測序帶來的市場容量,其還只是DNA測序商業應用市場的冰山一角。


在業內,DNA測序有著高貴的出身,其將堿基序列這一基因密碼破解,融合了IT技術與基因組學,將生物信息學這一新興學科開創和發展了出來。傳統的生物學技術被以生物信息學為代表的基因技術徹底顛覆了,對生命科學未來發展潮流起到引領作用,在醫療健康、環境保護、新能源、新材料、現代農業等熱門領域以它為代表的基因工程得到了廣泛地應用。


用途

該儀器的應用相當地廣泛,能夠進行進行dna測序、雜合子分析、單鏈構象多態性分析(sscp)、微衛星序列分析、長片段pcr、rt-pcr(定量pcr)等分析,臨床上不但能夠進行常規dna測序,而且還能夠進行

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DNA測序儀操作步驟

手工測序以及自動測序均屬于DNA序列測定,手工測序可分為maxam-gilbert化學降解法與sanger雙脫氧鏈終止法,事實上,目前dna序列分析的主流是自動測序。373型、377型、310型、3700和3100型等多種型號DNA測序儀均已經被美國pe abi公司生產出來了,在這幾款DNA測序儀中,臨床檢測實驗室使用最多的一種型號要屬310型。


操作步驟

一、pcr測序反應

1、取0.2ml的pcr管,用記號筆編號,在顆粒冰中插上pcr管,將2μl 滅菌去離子水、1μlm13(-21)引物、1μl 待測dna的正向引物、1μl pgem-3zf (+) 雙鏈dna、1μl 待測的質粒dna、1μl bigdye mix加入,輕礦物油或石蠟油不添加,將pcr管蓋緊,用手指彈管混合均勻,稍稍離心。


2、在2400型或9600型pcr儀上放上pcr管進行擴增,在98℃下變性兩分鐘之后進行pcr循環,60℃4min、50℃ 5s以及96℃ 10s為pcr的循環參數,經歷25個循環,在完成擴增以后將溫度設置為4℃保溫。


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二、使用醋酸鈉/乙醇法對pcr產物進行純化

1、離心混合物,往1.5ml ep管中轉移入擴增產物。


2、將醋酸鈉/乙醇混合液 25μl加入,充分振蕩,放到冰上10分鐘來使得dna沉淀。12000r/min在4℃條件下離心半個小時,仔細棄上清。


3、將50μl70%(v/v)的乙醇加入,進行2次洗滌沉,12000r/min在4℃條件下離心5分鐘,仔細棄上清以及管壁的液珠,再經過10到15分鐘的真空干燥沉淀。


三、電泳前處理測序pcr產物

1、在離心管中將12μl tsr加入,劇烈振蕩,,使其充分溶解,沉淀dna,稍稍離心。


2、往蓋體分離的0.2ml pcr管中轉移入溶液,稍稍離心。


3、熱變性(95℃ 2min)在pcr儀上進行,在冰中迅速降溫,等待上機。


四、將彩色測序圖譜分析或打印出來

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DNA測序方法

手工測序以及自動測序均屬于DNA序列測定,手工測序可分為maxam-gilbert化學降解法與sanger雙脫氧鏈終止法,事實上,目前dna序列分析的主流是自動測序。373型、377型、310型、3700和3100型等多種型號DNA測序儀均已經被美國pe abi公司生產出來了,在這幾款DNA測序儀中,臨床檢測實驗室使用最多的一種型號要屬310型。


測序方法

在分子生物學研究中,目的基因的進一步研究和改造是以DNA的序列分析為基礎的。Sanger(1977)發明的雙脫氧核糖核酸鏈末端終止法為用于測序的主要技術,Sanger測序法的應用非常的廣泛。Sanger法是以核苷酸開始于某一固定的點,終止于某一個隨機的特定的堿基處,并且在每個堿基后面進行熒光標記,使得以A、T、C、G結束的四組不同長度的一系列核苷酸產生,然后在尿素變性的PAGE膠上電泳進行檢測,從而使得可見的DNA堿基序列被獲取為依據。有所有四種脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)包含于每個反應,讓其擴增,并且有一種不同的限量的雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)混入將其終止。因為延伸所需要的3‘-OH基團為ddNTP所或缺,從而在G、A、T或C處擇性地終止延長的寡聚核苷酸。反應中相應的雙脫氧決定了終止點。為了使反應得到一組長幾個至千以上個,相差一個堿基一系列片斷,可以調整每一種dNTPs和ddNTPs的相對濃度。它們的起始點相同,然而終止點卻在不一樣的核苷酸上,大小不同的片段能夠通過高分辨率變性凝膠電泳分離。凝膠處理后能夠使用非同位素標記或者X-光膠片放射自顯影來進行檢測,這即是Sanger法測序的原理。


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現狀和意義

有50余個研究小組在威康信托基金會中,其是英國最大的生物醫學資助機構之一。雙向障礙病、冠心病、克羅恩氏病、風濕性關節炎、高血壓以及I型糖尿病和II型糖尿病等多疾病的基因的篩查這一項頗具野心的龐大計劃和挑戰由他們在過去的幾年開展

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DNA測序儀發展歷史和注意事項

手工測序以及自動測序均屬于DNA序列測定,手工測序可分為maxam-gilbert化學降解法與sanger雙脫氧鏈終止法,事實上,目前dna序列分析的主流是自動測序。373型、377型、310型、3700和3100型等多種型號DNA測序儀均已經被美國pe abi公司生產出來了,在這幾款DNA測序儀中,臨床檢測實驗室使用最多的一種型號要屬310型。


發展歷史

70年代末,化學法和雙脫氧手動測序,同位素標記法分別由WalterGilbert與FrederickSanger發明出來。


80年代中期,應用雙脫氧終止法原理,自動測序儀出現了,同位素被熒光取代了,計算機圖象識別。


90年代中期,測序儀得到了重大改進,凝膠電泳由集束化的毛細管電泳取代了。


2001年,人類基因組框架圖被完成。


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注意事項

1.bigdye熒光標記終止底物循環測序試劑盒為本實驗使用的測序試劑盒,通常650bp左右為可測dna長度,(98.5±0.5) %為本儀器dna測序精確度,如果儀器所需測定的長度高于650bp,不能辨讀的堿基n<2%,那么就需要設計另外的引物。能夠設計反向引物對同一模板進行測序,相互印證以便確保更為準確地測序。能夠人工核對n堿基,有時能夠將其辨讀出來,為了使測序的精確度提高,按照星號提示位置,能夠對該處彩色圖譜進行人工分析,進一步核對該處堿基。


2.對于測序用戶,僅僅需要將好的dna樣品和引物提供,一個測序pcr反應使用不一樣的模板,也就需要不同的dna量,pcr測序只需要比較少的模板的量,通常雙鏈dna需200~500ng,單鏈dna需50~100ng,pcr產物需30~90ng,dna的溶解zui好不要使用te緩沖液,而是使用去離子水或三蒸水。使用去離子水或三蒸水配成3.2pmol/μl的引物比較好


3、abi prism 310基因分析儀為精密儀器,必須由專人負責操作、管理和維護。


4、5μl為實驗測序pcr反應的總體積,并且沒有添加礦物油進行覆蓋,因此,pcr管蓋的密封性尤為重要,不僅需要在完成試劑添加后將pcr管蓋蓋緊,而且zui好選用pe公司的pcr管。如果在結束pcr以后,pcr液體積低于4~4.5μl,那么表明該pcr反應可

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DNA測序意義

手工測序以及自動測序均屬于DNA序列測定,手工測序可分為maxam-gilbert化學降解法與sanger雙脫氧鏈終止法,事實上,目前dna序列分析的主流是自動測序。373型、377型、310型、3700和3100型等多種型號DNA測序儀均已經被美國pe abi公司生產出來了,在這幾款DNA測序儀中,臨床檢測實驗室使用最多的一種型號要屬310型。


意義

全球最大的基因組測序及研究應用中心之一位于深圳的華大基因研究院,華大基因承擔了人類基因組計劃1%的工作任務,之后又對國際HAPmap計劃進行了參與與完成,并且將叫做“炎黃一號”di一個中國人也是di一個亞洲人的基因組測序完成了。


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DNA測序方法的飛速發展除了使人類的全基因組序列為我們所知曉,而且還使得我們充分掌握了小麥、水稻、家蠶以及很多細菌。此時,科學家們的新目標也就變成了對一段序列所代表的生物學意義的探明。用于編碼基因僅僅只有1.5%存在于核苷酸組成的龐大序列中,除此以外,扮演調控基因表達的角色有少許,其中功能未知的“垃圾DNA”占絕大部分,這一發現是科學家通過分析人類基因組序列獲得的。由表面可知,人與人之間有著繽紛復雜的不同之處,然而,深入到DNA水平上,卻僅僅存在0.1%基因編碼序列上的不同。大多數時候,人與人之間在一條序列上的差異只有一個核苷酸,科學家將這種現象命名為單核苷酸多態性(Single Nucleotide Polymorphisms,簡稱SNPs)。


從前將致病相關基因從數萬個人類基因中篩選出來猶如大海撈針。為了對這個基因究竟在何處想方設法的定位,科學家需要對同一個家族的多位患者的標本進行獲取。設計高通量藥物,致病或抑病基因的鑒定、疾病易感人群的篩查甚至個性化醫療由于具備了如今快速測序技術和SNPs這個強有力的工具而不再是需要向往的事。


用途

該儀器的應用相當地廣泛,能夠進行進行dna測序、雜合子分析、單鏈構象多態

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