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細胞破碎方法

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  細胞破碎是提取胞內產物的關鍵步驟,破碎方法的得當與否,直接影響到所提取產品的產量、質量和生產成本。實驗室對組織細胞的破碎方法很多,有機械方法、物理方法、化學方法和生物化學方法等。

細胞破碎條件

  在破碎前,材料常需要預處理,如動物材料要除去與實驗無關甚至有妨礙的結締組織,脂肪組織和血污等,植物種子需要除殼,微生物材料需將菌體和發酵液成分分開等。

  不同實驗規模、不同實驗材料和實驗要求,使用的破碎方法和條件也不同。一些堅韌組織,如肌肉、植物的根莖等,常需要強烈的攪拌或研磨作用,才能把其組織細胞破壞。而比較柔軟的組織如肝、腦等,用普通的玻璃勻漿器即可達到完全破壞細胞的目的。

  對同一實驗材料,由于實驗要求不同,采用的破碎方式也存在一定差異,如提取中的核酸和提取其中的核苷酸,前者必須保持十分溫和的條件,以保持分子的完整性;后者可采用強烈手段。

細胞破碎條件.jpg

機械法細胞破碎

  主要通過機械切力的作用使組織細胞破碎的方法,常用的器械有組織搗碎機、勻漿器、研缽和研磨、壓榨器等。

  1、組織搗碎機

  將材料配成稀糊狀液,放置于筒內約1/3體積,蓋緊筒蓋,將調速器先撥至最慢處,開動開關后,逐步加速至所需速度。一般用于動物組織、植物肉質種子、柔嫩的葉芽等,轉速可高達10000rpm/M以上。由于旋轉刀片的機械切力很大,制備一些較大分子如核酸則很少使用。

  2、勻漿器

  先將剪碎的組織置于管中,再套入研桿來回研磨,上下移動,即可將細胞研碎。勻漿器的研缽磨球和玻璃管內壁之間間隙保持在十分之幾毫米距離。制作勻漿器的材料,除玻璃外,還可以用硬質塑料、不銹鋼、人造熒光樹脂等。此法細胞破碎程度比高速組織搗碎機為高,適用于量少和動物臟器組織。

  存在的問題:較易造成堵塞的團狀或絲狀真菌,較小的革蘭氏陽性首以及有些亞細胞器,質地堅硬,易損傷勻漿閥,也不適合用該法處理。

  3、研缽

  多用于細菌或其他堅硬植物材料,研磨時常加入少量石英砂,玻璃粉或其他研磨劑,以提高研磨效果。

  4、細菌磨

  是一種改良了的研磨器,比研缽具有更大的研磨面積,而且低部有出口。操作時先把細菌和研磨粉調成糊狀,每次加入一小勺,研磨20-30秒即可將細菌細胞完全磨碎。

物理法細胞破碎

  主要通過各種物理因素使組織細胞破碎的方法。在生化制備中常用的方法有:

  1、反復凍溶法

  原理:因突然冷凍,細胞內冰晶的形成及胞內外溶劑濃度的突然改變而破壞細胞。

  方法:將待破碎的細胞在-20度以下冰凍,室溫融解,反復幾次,由于細胞內冰粒形成和剩余細胞液的鹽濃度增高引起溶脹,使細胞結構破碎。

  特點:此法適用于組織細胞,多用于動物性材料,對微生物細胞作用較差。

  2、急熱驟冷法

  將材料投入沸水中,維持85-90分鐘,至水浴中急速冷卻,此法可用于細菌及病毒材料。

  3、超聲波處理

  用一定功率的超聲波處理細胞懸液,使細胞急劇震蕩破裂,此法多適用于微生物材料,用大腸桿菌制備各種酶,常選用50-100毫克菌體/毫升濃度,頻高于15~20KHz的超聲波在高強度聲能輸入下可以進行細胞破碎。

  破碎機理:與空化現象引起的沖擊波和剪切力有關。超聲破碎的效率與聲頻、聲能、處理時間、細胞濃度及首種類型等因素有關。

  特點:①操作簡單,重復性較好,節省時間;②多用于微生物和組織細胞的破碎。

  存在問題:超聲波破碎在實驗室規模應用較普遍,處理少量樣品時操作簡便,液量損失少,但是超聲波產生的化學自由基團能使某些敏感性活性物質變性失活。而且大容量裝置聲能傳遞,散熱均有困難,應采取相應降溫措施。對超聲波敏感和核酸應慎用。空化作用是細胞破壞的直接原因,同時會產生活性氧,所以要加一些巰基保護劑。

細胞破碎儀.jpg

化學及生物化學法細胞破碎

  1、自溶法

  在一定pH和適當的溫度下,利用組織細胞內自身的酶系統將。此過程需較長時間,常用少量防腐劑如甲苯、氯仿等防止細胞的污染。

  2、酶溶法

  利用各種水解酶,如溶菌酶、纖維素酶、蝸牛酶、半纖維素酶、脂酶等,將細胞壁分解,使細胞內含物釋放出來。有些細菌對溶菌酶不敏感,加入少量巰基試劑或8摩爾尿素處理后,使之轉為對溶菌酶敏感而溶解。

  特點:①此法適用多種微生物;②具有作用條件溫和;③內含物成分不易受到破壞;④細胞壁損壞的程度可以控制。

  存在的問題:易造成產物抑制作用,這可能是導致胞內物質釋放率低的一個重要因素。而且溶酶價格高,限制了大規模利用。若回收溶酶,則又增加百分離純化溶酶的操作。另外酶溶法通用性差,不同菌種需選擇不同的酶。有一定局限性,不適宜大量的蛋白質提取,給進一步純化帶來困難。

  3、化學滲透法

  某些有機溶劑(如苯、甲苯)、抗生素、表面活性劑、金屬螯合劑、變性劑等化學藥品都可以改變細胞壁或膜的通透性從而使內合物有選擇地滲透出來。

  作用機理:化學滲透取決于化學試劑的類型以及細胞壁和膜的結構與組成。

  特點:①多用于破碎細菌,且作用比較溫和;②提取核酸時,常用此法破碎細胞。

  存在的問題:時間長,效率低;化學試劑毒性較強,同時對產物也有毒害作用,進一步分離時需要用透析等方法除去這些試劑;通用性差:某種試劑只能作用于某些特定類型的微生物細胞。

  無論用哪一種方法破碎組織細胞,都會使細胞內蛋白質或核酸水解酶釋放到溶液中,使大分子生物降解,導致天然物質量的減少,加入二異丙基氟磷酸(DFP)可以抑制或減慢自溶作用;加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性,加入苯磺酰氟化物(PMSF)也能清除蛋白水解酶活力,但不是全部,還可通過選擇pH、溫度或離子強度等,使這些條件都要適合于目的物質的提取。

 

2004-10-27 瀏覽次數:1969次
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